«Sinfonía de actividades celulares» revelada por la técnica de imágenes fluorescentes

Imágenes de células fluorescentes

Los investigadores del MIT han desarrollado una forma de obtener imágenes simultáneamente de hasta cinco moléculas diferentes dentro de una célula, dirigiendo a los reporteros brillantes a distintas ubicaciones dentro de la célula. Este enfoque podría permitir a los científicos aprender mucho más sobre las complejas redes de señalización que controlan la mayoría de las funciones celulares. Crédito: Cortesía de los investigadores.

La técnica de imágenes fluorescentes captura simultáneamente diferentes tipos de señales de múltiples ubicaciones en una celda viva.

Dentro de una sola célula, miles de moléculas, como proteínas, iones y otras moléculas de señalización, trabajan juntas para realizar todo tipo de funciones: absorber nutrientes, almacenar recuerdos y diferenciar en tejidos específicos, entre muchas otras.

Descifrar estas moléculas y todas sus interacciones es una tarea monumental. Durante los últimos 20 años, los científicos han desarrollado reporteros fluorescentes que pueden usar para leer la dinámica de moléculas individuales dentro de las células. Sin embargo, normalmente solo se pueden observar una o dos de estas señales a la vez, porque un microscopio no puede distinguir entre muchos colores fluorescentes.

MIT Los investigadores han desarrollado ahora una forma de obtener imágenes de hasta cinco tipos de moléculas diferentes a la vez, midiendo cada señal desde ubicaciones distintas y aleatorias en una célula. Este enfoque podría permitir a los científicos aprender mucho más sobre las complejas redes de señalización que controlan la mayoría de las funciones celulares, dice Edward Boyden, profesor de Neurotecnología Y. Eva Tan y profesor de ingeniería biológica, artes y ciencias de los medios, y ciencias cognitivas y cerebrales en MIT.

“Hay miles de moléculas codificadas por el genoma y están interactuando de formas que no comprendemos. Solo observándolos al mismo tiempo podemos comprender sus relaciones ”, dice Boyden, quien también es miembro del Instituto McGovern de Investigación del Cerebro del MIT y del Instituto Koch de Investigación Integrativa del Cáncer.

En un nuevo estudio, Boyden y sus colegas utilizaron esta técnica para identificar dos poblaciones de neuronas que responden a las señales de calcio de diferentes maneras, lo que puede influir en la forma en que codifican los recuerdos a largo plazo, dicen los investigadores.

Boyden es el autor principal del estudio, que se publicó el 23 de noviembre de 2020 en Célula. Los autores principales del artículo son el postdoctorado del MIT Changyang Linghu y la estudiante de posgrado Shannon Johnson.

Sinfonía de actividades celulares

“Al igual que escuchar el sonido de un solo instrumento de una orquesta está lejos de ser suficiente para apreciar completamente una sinfonía”, dice Linghu, “al permitir observaciones de múltiples señales celulares al mismo tiempo, nuestra tecnología nos ayudará a comprender la ‘sinfonía ‘de las actividades celulares «. Estas cuatro imágenes comparan varias formas en que los científicos hacen visible la actividad molecular, con la nueva técnica en la parte inferior derecha. Crédito: Cortesía de los investigadores. Editado por MIT News

Racimos fluorescentes

Para hacer visible la actividad molecular dentro de una célula, los científicos suelen crear reporteros fusionando una proteína que detecta una molécula objetivo con una proteína que brilla. “Esto es similar a cómo un detector de humo detecta el humo y luego enciende una luz”, dice Johnson, quien también es miembro del Centro Yang-Tan de Terapéutica Molecular. La proteína brillante más utilizada es la proteína verde fluorescente (GFP), que se basa en una molécula que se encuentra originalmente en una medusa fluorescente.

“Por lo general, un biólogo puede ver uno o dos colores al mismo tiempo en un microscopio, y muchos de los reporteros son verdes, porque se basan en la proteína verde fluorescente”, dice Boyden. «Lo que ha faltado hasta ahora es la capacidad de ver más de un par de estas señales a la vez».

“Al igual que escuchar el sonido de un solo instrumento de una orquesta está lejos de ser suficiente para apreciar completamente una sinfonía”, dice Linghu, “al permitir observaciones de múltiples señales celulares al mismo tiempo, nuestra tecnología nos ayudará a comprender la ‘sinfonía ‘de las actividades celulares «.

Para aumentar la cantidad de señales que podían ver, los investigadores se propusieron identificar las señales por ubicación en lugar de por color. Modificaron los reporteros existentes para hacer que se acumularan en grupos en diferentes ubicaciones dentro de una celda. Hicieron esto agregando dos pequeños péptidos a cada reportero, lo que ayudó a los reporteros a formar grupos distintos dentro de las células.

«Es como tener al reportero X atado a un ladrillo LEGO y al reportero Z atado a una pieza de K’NEX; solo los ladrillos LEGO se encajarán en otros ladrillos LEGO, lo que hará que solo el reportero X se agrupe con más del reportero X», dice Johnson. .

Con esta técnica, cada celda termina con cientos de grupos de reporteros fluorescentes. Después de medir la actividad de cada grupo bajo un microscopio, basándose en la fluorescencia cambiante, los investigadores pueden identificar qué molécula se estaba midiendo en cada grupo al preservar la célula y teñir las etiquetas de péptidos que son únicas para cada informador. Las etiquetas de péptidos son invisibles en la célula viva, pero pueden teñirse y verse después de que se obtienen las imágenes en vivo. Esto permite a los investigadores distinguir señales para diferentes moléculas aunque todas tengan el mismo color fluorescente en la célula viva.

Usando este enfoque, los investigadores demostraron que podían ver cinco señales moleculares diferentes en una sola célula. Para demostrar la utilidad potencial de esta estrategia, midieron las actividades de tres moléculas en paralelo: calcio, AMP cíclico y proteína quinasa A (PKA). Estas moléculas forman una red de señalización que participa en muchas funciones celulares diferentes en todo el cuerpo. En las neuronas, juega un papel importante en traducir una entrada a corto plazo (de las neuronas aguas arriba) en cambios a largo plazo, como el fortalecimiento de las conexiones entre neuronas, un proceso que es necesario para aprender y formar nuevos recuerdos.

Al aplicar esta técnica de imágenes a las neuronas piramidales del hipocampo, los investigadores identificaron dos subpoblaciones novedosas con diferentes dinámicas de señalización de calcio. Una población mostró respuestas lentas al calcio. En la otra población, las neuronas tuvieron respuestas de calcio más rápidas. La última población tuvo respuestas de PKA más grandes. Los investigadores creen que esta mayor respuesta puede ayudar a mantener cambios duraderos en las neuronas.

Redes de señalización de imágenes

Los investigadores ahora planean probar este enfoque en animales vivos para que puedan estudiar cómo las actividades de la red de señalización se relacionan con el comportamiento, y también para expandirlo a otros tipos de células, como las células inmunes. Esta técnica también podría ser útil para comparar patrones de redes de señalización entre células de tejido sano y enfermo.

En este artículo, los investigadores demostraron que podían registrar cinco señales moleculares diferentes a la vez, y al modificar su estrategia existente, creen que podrían llegar a 16. Con trabajo adicional, ese número podría llegar a los cientos, dicen.

«Eso realmente podría ayudar a resolver algunas de estas preguntas difíciles sobre cómo funcionan juntas las partes de una célula», dice Boyden. «Uno podría imaginar una era en la que podamos ver todo lo que sucede en una célula viva, o al menos la parte relacionada con el aprendizaje, o con la enfermedad, o con el tratamiento de una enfermedad».

Lea Espiando en tiempo real la sinfonía de señales celulares que impulsan la biología para obtener más información sobre esta investigación.

Referencia: “Multiplexación espacial de reporteros fluorescentes para imágenes dinámicas de redes de transducción de señales” por Changyang Linghu, Shannon L. Johnson, Pablo A. Valdes, Or A. Shemesh, Won Min Park, Demian Park, Kiryl D. Piatkevich, Asmamaw T. Wassie, Yixi Liu, Bobae An, Stephanie A. Barnes, Orhan T. Celiker, Chun-Chen Yao, Chih-Chieh (Jay) Yu, Ru Wang, Katarzyna P. Adamala, Mark F. Bear, Amy E. Keating y Edward S. Boyden, 23 de noviembre de 2020, Célula.
DOI :: 10.1016 / j.cell.2020.10.035

La investigación fue financiada por la beca Friends of the McGovern Institute; la Beca J. Douglas Tan; Lisa Yang; el Centro Yang-Tan de Terapéutica Molecular; John Doerr; el Proyecto de Filantropía Abierta; el programa de becarios de la facultad HHMI-Simons; el Programa de Ciencias Humanas de la Frontera; el Laboratorio de Investigación del Ejército de los Estados Unidos; el MIT Media Lab; el Fondo de Innovación del Instituto Picower; los Institutos Nacionales de Salud, incluido el Premio Pionero del Director de los NIH; y la Fundación Nacional de Ciencias.